Karakterisasi Antimikroba Erythorbyl Laurate untuk Aplikasi Praktis dalam Makanan dan Kosmetik

Karakterisasi Antimikroba Erythorbyl Laurate untuk Aplikasi Praktis dalam Makanan dan Kosmetik – Dalam studi ini, spektrum antimikroba dari erythorbyl larate (EL) terhadap bakteri dan jamur, yang menyebabkan penyakit kulit yang ditularkan melalui makanan dan infeksi, dievaluasi untuk aplikasi praktisnya dalam makanan dan kosmetik. Selanjutnya, pengaruh faktor lingkungan termasuk pH, stres oksidatif, dan media dispersi pada aktivitas antimikroba EL diselidiki. Tiga bakteri Gram-positif dan tiga kapang rentan terhadap 3,0 mM EL, sedangkan ragi rentan terhadap 6,0 mM EL.

Karakterisasi Antimikroba Erythorbyl Laurate untuk Aplikasi Praktis dalam Makanan dan Kosmetik

agion-tech  – Terbukti EL mempertahankan aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus setelah dioksidasi sedangkan aktivitas antibakteri terhadap tiga bakteri Gram-positif termasuk S. aureus , Bacillus cereus , dan Listeria monocytogenesmeningkat secara signifikan seiring dengan penurunan pH dari 7,0 menjadi 5,0. Selain itu, EL menunjukkan efek bakterisida terhadap bakteri Gram-positif dan Gram-negatif dalam emulsi minyak dalam air.

Baca Juga :  5 Hal Yang Salah Dengan Deodoran Anda

Perlakuan 5,0 mM EL selama 4 jam mengurangi 5,29 ± 0,24, 6,01 ± 0,18, 5,95 ± 0,13, dan 6,24 ± 0,30 log CFU/mL terhadap S. aureus , L. monocytogenes , Pseudomonas aeruginosa, dan Escherichia coli, berturut-turut. Dalam studi seleksi resistensi multipassage, diamati konsentrasi penghambatan minimum EL terhadap S. aureus tidak meningkat lebih dari 20 bagian, menunjukkan EL mungkin tidak mengembangkan resistensi obat bakteri. Penelitian ini menunjukkan EL berpotensi untuk diaplikasikan sebagai aditif multifungsi dalam makanan dan kosmetik.

Perkenalan

Oksidasi lipid makanan dan kosmetik telah dianggap sebagai bahaya utama bagi kesehatan konsumen. Selain itu, kontaminasi mikroba mempengaruhi sifat fisik dan kimia makanan dan kosmetik. Oleh karena itu, pengawet telah digunakan untuk mengontrol oksidasi lipid dan kontaminasi mikroba dalam industri makanan dan kosmetik. Sebelumnya, erythorbyl larate (EL) disarankan sebagai pengemulsi multifungsi baru dengan aktivitas antioksidan dan antibakteri untuk mengontrol oksidasi lipid dan kontaminasi mikroba dengan senyawa tunggal.

Sebuah studi sebelumnya menyelidiki EL memiliki aktivitas antibakteri terhadap patogen bawaan makanan Gram-positif termasuk Staphylococcus aureus , Bacillus cereus , dan Listeria monocytogenes . Konsentrasi penghambatan minimum (MICs) dan konsentrasi bakterisida minimum (MBCs) EL terhadap bakteri Gram-positif ini ditentukan, dan mekanisme antibakteri dianggap sebagai gangguan pada membran sel bakteri.

Selain itu, diselidiki bahwa EL menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih efektif daripada asam eritorbat dalam sistem emulsi minyak dalam air (O/W) karena bagian antioksidannya terletak pada antarmuka tetesan di mana oksidasi lipid sebagian besar terjadi. Namun, tidak ada penelitian yang meneliti sifat antibakteri EL dalam emulsi O/W, yang dianggap sebagai sistem terbaik untuk aplikasi EL.

Makanan dan kosmetik dibuat pada berbagai nilai pH, yang mempengaruhi aktivitas antimikroba pengawet, yang disebabkan oleh perubahan struktural. Selain itu, struktur EL mungkin berubah setelah mulai bertindak sebagai antioksidan. Dilaporkan bahwa ranalexin, peptida antimikroba, mempertahankan aktivitas antimikrobanya setelah teroksidasi, sementara katekin dengan aktivitas antioksidan menunjukkan efek antimikroba ketika berfungsi sebagai antioksidan.

Spektrum antimikroba dari agen antimikroba adalah salah satu pertimbangan penting untuk aplikasi praktis karena kontaminasi mikroba pada makanan dan kosmetik dapat disebabkan oleh bakteri, ragi, dan jamur [ 12 ]. Selain itu, meningkatnya kekhawatiran tentang resistensi bakteri terhadap antibiotik telah mendorong kebutuhan untuk mencari agen antibakteri alternatif untuk aplikasi klinis, serta digunakan dalam makanan dan kosmetik. Karena tidak ada laporan bakteri yang mengembangkan resistensi terhadap asam lemak, EL mungkin tidak menginduksi resistensi bakteri.

Investigasi mendasar pada sifat antibakteri EL berkaitan dengan aktivitas antibakteri dan cara kerja dilakukan pada penelitian sebelumnya, tetapi tidak ada penelitian yang dilakukan untuk membawa pengetahuan rinci tentang sifat antimikroba EL untuk aplikasi praktis. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah evaluasi komprehensif sifat antimikroba EL untuk aplikasi praktis dalam makanan dan kosmetik.

Spektrum antimikroba EL terhadap bakteri, ragi, dan jamur diselidiki, dan studi resistensi dilakukan untuk mengetahui resistensi bakteri terhadap EL. Selanjutnya, efek perubahan struktural pada EL karena protonasi oleh variasi pH dan oksidasi pada aktivitas antibakterinya dievaluasi. Akhirnya, aktivitas antibakteri EL dalam sistem emulsi M/A diselidiki untuk menilai penerapannya pada makanan dan kosmetik berbasis emulsi.

Bahan

Lipase amobil, dari Candida antarctica (triasilgliserol hidrolase, EC 3.1.1.3; Novozym 435) dengan aktivitas katalitik 7.000 PLU/g (aktivitas PLU mengacu pada milimol propil laurat yang disintesis per menit pada 60°C), dibeli dari Novozymes (Bagsvaerd, Denmark). Asam erythorbic (=99,0%), asam laurat (=99,0%), amfoterisin B, dan ampisilin dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Monolaurin (>98,0%) dibeli dari Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Jepang). Tween-20 dibeli dari Ilshinwells (Cheongju, Korea), dan minyak bunga matahari dibeli dari Ottogi (Seoul, Korea). Semua bahan kimia lainnya adalah kelas analitis.

Produksi Erythobyl Laurate

EL diproduksi dalam sistem multifase gas-padat-cair. Esterifikasi antara asam eritorbat dan asam laurat dikatalisis oleh lipase amobil (Novozym 435) selama 95 jam. Volume total adalah 450 mL, dan rasio molar asam eritorbat (0,97 mol) terhadap asam laurat (1,93 mol) adalah 1: 2. Jumlah enzim adalah 840 PLU/mL (0,12 g/mL), dan gas nitrogen digelembungkan pada laju aliran 6,0 L/menit. Asam laurat dipreinkubasi pada suhu 60°C selama 20 menit pada reaktor untuk dicairkan.

Analisis kuantitatif EL dilakukan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC; LC-2002; JASCO, Tokyo, Jepang) dengan kolom berbasis silika (5,0? m , 4,6 × 150 mm; Luna C18; Phenomenex, Torrance, CA , USA) dan detektor ultraviolet (UV) (UV-2075; JASCO). Fasa geraknya adalah asetonitril/air/asam asetat (90 : 5:5, v/v/v) dengan laju alir 1,0 mL/menit. Puncak dalam kromatogram HPLC dikonfirmasi menurut waktu retensi standar EL. Konsentrasi EL ditentukan dengan menggunakan kurva standar EL, yang dihasilkan dengan mengintegrasikan area puncak pada 265 nm menggunakan Borwin (ver. 1.21; JASCO).

Bakteri, Jamur, dan Media

Bakteri dan jamur untuk uji kerentanan dipilih dari patogen penyebab penyakit kulit menular dan penyakit bawaan makanan. Ini termasuk tiga bakteri Gram-positif ( Propionibacterium acnes ATCC 6919, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, dan Clostridium perfringens ATCC 13124), tiga kapang ( Trichophyton mentagrophytes ATCC 18748, Rhizopus oryzae ATCC 10404, dan Aspergillus nidulans ATCC 10074), dan satu ragi (10074) , albicans KCTC 7678).

S. pyogenes ATCC 19615 dikultur dalam tryptic soy agar (TSA) pada suhu 37°C selama 24 jam dalam atmosfer 5,0% CO2 . C. perfringens ATCC 13124 dan P. acnes ATCC 6919 dikultur dalam TSA pada suhu 37°C dalam suasana anaerob selama 1 dan 5 hari, masing-masing. Semua kapang dikultur dalam potato dextrose agar (PDA) pada suhu 25 ° C selama 5 hari, dan ragi dikultur dalam ragi malt agar (YMA) pada suhu 25 ° C selama 2 hari.

Uji Difusi Disk

Kerentanan antimikroba terhadap EL dinilai menggunakan uji difusi cakram dengan mengacu pada pedoman Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Inokula bakteri Gram-positif dan ragi dibuat dengan suspensi koloni langsung dalam kaldu kedelai tryptic (TSB) dan ragi manitol kaldu (YMB), masing-masing, setara dengan 0,5 suspensi McFarland, dan diinokulasi jamur (5 × 10 4spora/mL) dalam kaldu dekstrosa kentang (PDB).

Suspensi bakteri dan jamur diinokulasi pada permukaan pelat agar. Bakteri gram positif, kapang, dan ragi diinokulasi pada permukaan TSA, PDA, dan YMA, masing-masing. EL, kontrol negatif (TSB, PDB, dan YMB dengan 2,0% dimetil sulfoksida), dan antibiotik (10 ppm ampisilin dan 250 ppm amfoterisin B) disiapkan. Cakram kertas (ketebalan 8,0 mm) diletakkan pada permukaan agar, dan 40,0? L sampel dibagikan pada cakram; plat kemudian dikeringkan selama 5 menit.

Pelat yang diinokulasi dengan S. pyogenes ATCC 19615 dan C. perfringens ATCC 13124 diinkubasi pada 37°C, secara anaerobik selama 1 hari, dan dengan P. acnes ATCC 6919 diinkubasi selama 5 hari. Pelat yang diinokulasi dengan cetakan diinkubasi pada suhu 25°C selama 2 hari dan T. mentagrophytes ATCC 18748 diinkubasi selama 7 hari; ragi diinkubasi pada 25 ° C selama 2 hari, dan zona bening kemudian dianalisis.

Perubahan Struktural di EL

Derajat protonasi EL menurut pH diprediksi dengan menggunakan Chemicalize.org . EL dilarutkan dalam 2,0% dimetil sulfoksida dalam 100 mM buffer universal pada pH 5,0, 6,0, atau 7,0 untuk memprotonasi EL.

Pada pH netral dan basa, asam askorbat sangat tidak stabil karena konversinya lebih cepat menjadi asam dehidroaskorbat. Asam dehidroaskorbat juga terdegradasi lebih cepat pada pH basa (7,0-8,0) dibandingkan pada pH asam (3,0-5,0). Demikian pula, EL mungkin juga teroksidasi dan terdegradasi pada pH basa. Oleh karena itu, EL ditambahkan ke 5,0% dimetil sulfoksida dalam 50 mM buffer Tris-HCl pada pH 8,0 untuk oksidasi. Derajat oksidasi disajikan sebagai rata-rata penurunan dalam bentuk EL tereduksi yang diukur dengan HPLC dalam rangkap tiga.

Evaluasi Aktivitas Antimikroba

Untuk mengevaluasi aktivitas antimikroba EL menurut derajat protonasi, 100? L inokulum S. aureus ATCC 12692, L. monocytogenes ATCC 19115, atau B. cereus ATCC 10876, setara dengan 0,5 suspensi McFarland, ditambahkan ke? 100 L buffer universal yang mengandung EL. Unit pembentuk koloni (CFU) dalam alikuot 100? L dihitung dengan menyiapkan pengenceran serial dalam 100 mM buffer universal pada pH 5,0, 6,0, dan 7,0; pelapisan dilakukan dalam rangkap tiga untuk setiap pengenceran dengan pelat TSA, selama 1 jam setelah inkubasi pada 37°C selama 1 jam. Kemudian masing-masing cawan diinkubasi pada suhu 37°C selama 18 jam.

Aktivitas antimikroba EL menurut derajat oksidasi dievaluasi menggunakan uji MIC setelah penyimpanan selama 0, 6, 15, 24, dan 48 jam pada suhu 40°C. Bentuk EL yang tereduksi dikuantifikasi dengan HPLC dalam rangkap tiga. Untuk uji MIC, buffer Tris-HCl yang mengandung EL ditambahkan 1,25% dimetil sulfoksida dalam TSB. S. aureus ATCC 12692 diuji untuk menentukan KHM bentuk oksidasi EL, dan inokulum bakteri diencerkan dalam 2,00% dimetil sulfoksida dalam TSB sebagai standar 0,5 McFarland.

MIC ditentukan dengan menggunakan uji mikrodilusi kaldu. Pengenceran serial dari setiap konsentrasi EL teroksidasi yang diinginkan disiapkan dalam TSB steril hingga volume akhir 100? L dalam pelat mikro 96-sumur. Kemudian, masing-masing sumur diinokulasi dengan 100? .L organisme uji di TSB. KHM diperoleh sebagai konsentrasi terendah dimana senyawa uji menghambat pertumbuhan bakteri setelah inkubasi selama 12 jam pada suhu 37°C.

Studi Seleksi Perlawanan Multipassage

Inokulum disiapkan sebagai suspensi 0,5 McFarland setelah menginkubasi S. aureus ATCC 12692 dalam TSB pada suhu 37°C selama 18 jam. Bagian serial dilakukan setiap 18 jam di TSB (2,0% dimetil sulfoksida). Strain diperlakukan dengan 2 kali lipat seri pengenceran EL dalam 200? L kaldu di piring 96-sumur. Untuk setiap bagian berikutnya, alikuot 2? L diambil dari sumur dengan konsentrasi di bawah MIC yang sesuai dengan kekeruhan kontrol pertumbuhan dan digunakan untuk menginokulasi seri pengenceran untuk bagian berikutnya. Setiap bagian dilakukan sampai 20 bagian berturut-turut diselesaikan.

Hasil dan Pembahasan Spektrum Antimikroba EL

Tiga bakteri, tiga kapang, dan satu ragi, yang menyebabkan penyakit bawaan makanan dan penyakit kulit menular, dipilih untuk evaluasi spektrum antimikroba EL. Dalam uji difusi cakram, EL menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap tiga bakteri Gram-positif, satu ragi, dan tiga kapang. P. acnes , S. pyogenes , C. perfringens , A. nidulans, R. oryzae, dan T. mentagrophytes rentan terhadap 3 mM EL dan C. albicans hingga 6 mM EL. Hasil ini menunjukkan bahwa EL dapat diterapkan pada makanan dan kosmetik untuk mengendalikan jamur, ragi, dan bakteri Gram-positif yang menyebabkan penyakit bawaan makanan dan penyakit kulit menular.